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PCR“异常曲线”分析(二)

发表时间:2021-09-22 15:26


一、阳性样本检测不出来,且阳性对照ct值靠后,原因是什么?

              

                 图1                          图2

答:图1与图2为同一试剂同一阳性对照的扩增结果;图1为金属浴加热后直接上机扩增,没进行上下颠倒混匀的步骤;图2是严格按照实验室操作,加热后颠倒混匀8-10次,离心后上机扩增;图2 ct值4左右,图1 ct值9左右。第二步颠倒混匀不做,直接导致样本ct值靠后。

1)金属浴加热后,颠倒混匀这步骤没有做,导致试剂没有混匀,影响试剂扩增,导致ct值靠后;

2)试剂保存不当,导致试剂中酶效价变低(干粉应存于-20℃,防潮保存)。


二、阴性对照出现阳性结果什么原因?怎么处理?


1)污染:阴性对照有“S”曲线,且机器显示结果为“阳性”;

处理方法:a重复实验,严格按照说明书上面的步骤操作,排除操作问题,

b打开新的试剂盒测试,若结果没问题,则试剂盒在操作中被污染;如结果仍被污染,则判断为实验室污染

c用75%酒精擦拭没开封的8连管铝箔袋,自然干后冻起来

2)阴性对照有“S”曲线,且机器显示结果为“阳性”;

处理方法:将“DRn/Rn”选项钩掉,查看原始荧光曲线,若曲线为斜直线,可通过调整阈值及基线,将阴性曲线调整到基线下方。三、为什么同一个样本重复几孔后ct值差别较大?


三、为什么同一个样本重复几孔后ct值差别较大?


答:1)若是强阳性样本重复后ct值差别较大,为实验过程操作问题导致;

2)若是弱阳性样本重复后ct值差别大,这种现象是正常的;因为样本为弱阳性,病毒含量较低,酶与模板结合概率及时间长短不一定,导致ct值差别较大。


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