PCR“异常曲线”分析（二）

一、阳性样本检测不出来，且阳性对照ct值靠后，原因是什么？

                 图1                          图2

答：图1与图2为同一试剂同一阳性对照的扩增结果；图1为金属浴加热后直接上机扩增，没进行上下颠倒混匀的步骤；图2是严格按照实验室操作，加热后颠倒混匀8-10次，离心后上机扩增；图2 ct值4左右，图1 ct值9左右。第二步颠倒混匀不做，直接导致样本ct值靠后。

1）金属浴加热后，颠倒混匀这步骤没有做，导致试剂没有混匀，影响试剂扩增，导致ct值靠后；

2）试剂保存不当，导致试剂中酶效价变低（干粉应存于-20℃，防潮保存）。

二、阴性对照出现阳性结果什么原因？怎么处理？

1）污染：阴性对照有“S”曲线，且机器显示结果为“阳性”；

处理方法：a重复实验，严格按照说明书上面的步骤操作，排除操作问题，

b打开新的试剂盒测试，若结果没问题，则试剂盒在操作中被污染；如结果仍被污染，则判断为实验室污染

c用75%酒精擦拭没开封的8连管铝箔袋，自然干后冻起来

2）阴性对照有“S”曲线，且机器显示结果为“阳性”；

处理方法：将“DRn/Rn”选项钩掉，查看原始荧光曲线，若曲线为斜直线，可通过调整阈值及基线，将阴性曲线调整到基线下方。三、为什么同一个样本重复几孔后ct值差别较大？

三、为什么同一个样本重复几孔后ct值差别较大？

答：1）若是强阳性样本重复后ct值差别较大，为实验过程操作问题导致；

2）若是弱阳性样本重复后ct值差别大，这种现象是正常的；因为样本为弱阳性，病毒含量较低，酶与模板结合概率及时间长短不一定，导致ct值差别较大。