PCR“异常曲线”分析（一）

在PCR中，随着温度的变化发生变性－复性－延伸－三步为一个完整的循环。

在MIRA（多酶恒温快速扩增）中，DNA双链的打开，引物与模板DNA链的结合，链的延伸复制，都是在恒温条件下靠酶来进行（重组酶单链结核蛋白，DNA聚合酶等），不同酶在同一时间执行各自功能，即一个反应管在同一时间内，同时在发生着双链打开、引物结合、链延伸这些步骤，而不是依赖温度每个阶段只能执行一个步骤，所以MIRA没有像PCR意义上的"循环数"，也就没有典型的“Ct值”。MIRA中的“Ct值”，是定义30秒为一个“循环”，因为模板浓度的高低，荧光值达到检出水平的时间也有早晚，所以MIRA的“Ct”也可以表示样本核酸含量的高低。设备中的"tt"值（即timethreshold），达到阈值的时间。Ct会根据您设置的一个循环的时间（30秒）换算出来，结果显示tt还是ct是可以选择和设置的。

1、MIRA正常扩增曲线

2、异常曲线分析

1）实验结果向基线下面起峰值

是由于实验结果的参数设置值不正确导致曲线异常；在参数设置中，基线起始值为1，终止值为5，把自动基线去掉，重新点击，分析，完成，获得准确曲线。

2）阴性样本曲线异常，上下波动，或出现很多大负荧光强度值，或出现很大正荧光强度值的原因？

在操作过程中，上下颠倒混匀这一步没有混合均匀，导致曲线异常；建议每次上下颠倒至少8-10次，保证每次点颠倒液体能全部甩到管底，混匀后观察管壁是否有白色粉末残留，若液体为透明，没有粉末残留为混合均匀。