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PCR“异常曲线”分析(一)

发表时间:2021-09-18 12:08

PCR中,随着温度的变化发生变性-复性-延伸-三步为一个完整的循环。

MIRA(多酶恒温快速扩增)中,DNA双链的打开,引物与模板DNA链的结合,链的延伸复制,都是在恒温条件下靠酶来进行(重组酶单链结核蛋白,DNA聚合酶等),不同酶在同一时间执行各自功能,即一个反应管在同一时间内,同时在发生着双链打开、引物结合、链延伸这些步骤,而不是依赖温度每个阶段只能执行一个步骤,所以MIRA没有像PCR意义上的"循环数",也就没有典型的“CtMIRA中的“Ct,是定义30秒为一个循环,因为模板浓度的高低,荧光值达到检出水平的时间也有早晚,所以MIRA“Ct”也可以表示样本核酸含量的高低。设备中的"tt"值(即timethreshold),达到阈值的时间。Ct会根据您设置的一个循环的时间(30秒)换算出来,结果显示tt还是ct是可以选择和设置的。

1、MIRA正常扩增曲线

2、异常曲线分析

1)实验结果向基线下面起峰值

是由于实验结果的参数设置值不正确导致曲线异常;在参数设置中,基线起始值为1,终止值为5,把自动基线去掉,重新点击,分析,完成,获得准确曲线。

2)阴性样本曲线异常,上下波动,或出现很多大负荧光强度值,或出现很大正荧光强度值的原因?

在操作过程中,上下颠倒混匀这一步没有混合均匀,导致曲线异常;建议每次上下颠倒至少8-10次,保证每次点颠倒液体能全部甩到管底,混匀后观察管壁是否有白色粉末残留,若液体为透明,没有粉末残留为混合均匀。


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